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《针刺研究》月刊 北大核心

作者:优质期刊论文发表网  来源:www.yzqkw.com  发布时间:2019/6/25 13:29:15  

基本信息

曾用刊名:针刺麻醉

主办单位:中国中医研究院针灸所;中国针灸学会

出版周期:月刊

ISSN:1000-0607

CN:11-2274/R

出版地:北京市

语种:中文

开本:大16开

邮发代号:82-171

创刊时间:1976

出版信息

专辑名称:医药卫生科技

专题名称:中医学

出版文献量:5174篇

总下载次数:679877次

总被引次数:49381次

评价信息

(2018版)复合影响因子:3.020

(2018版)综合影响因子:1.917

该刊被以下数据库收录:

CA化学文摘(美)(2014)

JST日本科学技术振兴机构数据库(日)(2018)

CSCD中国科学引文数据库来源期刊(2017-2018年度)(含扩展版)

北京大学《中文核心期刊要目总览》来源期刊:

2008年版,2011年版,2014年版,2017年版;

收录论文范文

艾灸干预促进创伤大鼠伤口愈合的机制研究

摘要:目的:通过观察艾灸对参与创伤愈合炎性反应阶段的细胞因子表达的影响,探讨艾灸促进伤口愈合的机制。方法:SD雄性大鼠随机分为正常组(6只)、模型组(39只)和艾灸组(39只)。采用直径8mm的取皮器从大鼠背部正中线肩胛下角2cm处钻取全层皮肤制备皮肤创伤模型。造模后即刻至造模后第5天每天给予创伤局部25min的艾灸干预。采用免疫荧光染色观察模型组和艾灸组大鼠创伤局部组织血管重建情况。造模后第1、2、3、5天采用液态芯片法检测创伤模型大鼠血清中白细胞介素(IL)-1α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α、血管内皮生长因子(VEGF)的含量。结果:与模型组比较,造模后第1天艾灸组大鼠血清中IL-1α和IL-6的含量显著升高(P<0.05),第1、2天艾灸组血清中IL-1β的含量显著升高(P<0.05),第3天艾灸组血清中IL-1α和IL-6的含量显著降低(P<0.05)。艾灸组大鼠前3dMIP-1α的含量均升高,且在造模后第2天明显升高(P<0.05)。艾灸组大鼠造模后第1天IL-4、IL-10含量显著升高(P<0.05),造模后第3天显著降低(P<0.05)。艾灸组大鼠造模后第1、2天血清中VEGF的含量显著升高(P<0.01,P<0.05)。艾灸组大鼠造模后第5天创伤组织中VEGF的含量显著升高(P<0.01)。艾灸组大鼠造模后第5天创伤组织中新生血管数量明显增加。结论:艾灸通过调控促炎细胞因子促进创伤炎性反应的同时,也调控了抗炎细胞因子在这一过程中的作用,促进并提前结束创伤愈合的炎性阶段,使创伤愈合提前进入增殖修复期,从而促进伤口愈合。

关键词:皮肤创伤;艾灸干预;促炎因子;抗炎因子;血管内皮生长因子;

伤口愈合包含一系列复杂的协同动态事件,包括止血、炎性反应、增殖和重塑4个阶段。炎性期是伤口愈合的关键时期[1],巨噬细胞是炎性期至关重要的免疫细胞,不同表型的巨噬细胞分别在炎性反应和组织修复中发挥重要作用[2,3,4]。白细胞介素(IL)-1α与中性粒细胞募集关系密切,而IL-1β促进巨噬细胞的招募和保留[5],经典活化的巨噬细胞M1型分泌IL-1、IL-6等促炎细胞因子和趋化因子,IL-10、IL-4、IL-13等抗炎细胞因子则可以直接或者间接促进巨噬细胞活化为M2型[6,7],M2型具有抗炎作用,参与组织修复和重建。研究[8]证明,约15%的糖尿病患者受到创伤愈合不良的困扰,糖尿病创伤组织中就存在巨噬细胞活化异常的现象,表现为早期M1巨噬细胞活化不足,以及M2活化延迟[9,10]。细胞和生长因子反应降低等一系列机制导致外周血流量减少和局部血管生成减少,可能是糖尿病足溃疡患者伤口愈合不良的原因[10]。血管内皮生长因子(VEGF)及受体在促进血管生成,调节糖尿病大鼠巨噬细胞表型方面发挥重要作用[11]。另有研究[12]显示,艾灸可以通过增加血管内皮细胞和VEGF表达促进切线伤模型大鼠的创伤愈合,并且可以调节慢性皮肤溃疡大鼠创面组织中巨噬细胞的数量[13]。本课题组前期研究[14]结果也显示,艾灸可以促进创伤模型大鼠伤口愈合,并且促进了创伤炎性期炎性细胞,特别是巨噬细胞向伤口局部的迁移。因此,巨噬细胞可能是艾灸调控创伤炎性反应、促进伤口愈合的关键,而复杂的细胞因子交互作用可能在此过程发挥重要作用。本研究旨在通过观察艾灸对参与创伤愈合炎性反应细胞因子表达的影响,探讨艾灸促进伤口愈合的机制。

1材料与方法

1.1动物与分组

健康雄性SPF级SD成年大鼠84只,10~12周龄,体质量(220±20)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证编号:SCXK(京)2016-0002。实验动物适应性饲养1周后,随机分为正常组(6只),模型组1d(9只),模型组2d(9只),模型组3d(9只),模型组5d(12只),艾灸组1d(9只),艾灸组2d(9只),艾灸组3d(9只),艾灸组5d(12只)。实验过程遵守国家科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》以及中国中医科学院针灸研究所2005年《实验室管理条例》中有关动物的使用及伦理学的规定。

1.2主要试剂及仪器

异氟烷(河北一品制药股份有限公司),艾条(18mm×200mm,南阳华康艾制品有限公司),小鼠CD31抗体(美国Abcam),Alexa488荧光素化山羊抗小鼠二抗、核酸特异性荧光染料DAPI(美国Molecular Probes),蛋白酶抑制剂、BCA蛋白定量试剂盒(美国Sigma),PMSF(瑞士Roche),BioPlex细胞因子试剂盒(美国Bio-Rad)。Bio-Plex200悬浮芯片系统(美国Bio-Rad),FV1200激光共聚焦显微镜(日本Olympus),恒冷箱冰冻切片机(德国Thermo)。

1.3模型制备方法

大鼠在异氟烷(流量0.8L/min,浓度2%)吸入麻醉状态下俯卧位置于手术台上,将大鼠局部皮肤剃毛后用75%乙醇消毒皮肤,在背部正中线上肩胛下角2cm处,采用直径8mm的取皮器钻取全层皮肤,然后用3M敷料和胶带包扎固定。

1.4干预方法

艾灸组在异氟烷(流量0.8L/min,浓度1%)浅麻醉状态下,用直径18mm的艾条,距离皮肤2cm高,创面外缘5mm处,分别在造模即刻、造模后第1~5天,施以艾灸回旋灸,每次25min,每日1次,共干预6次。模型组大鼠给予与艾灸组相同条件的异氟烷麻醉,不做其他干预处理。正常组大鼠不做干预处理。

1.5观察指标及检测方法

组织取材及样品制备:造模后第1、2、3、5天艾灸干预后,相应时间点模型组和艾灸组动物在异氟烷(流量0.8L/min,浓度3%)麻醉状态下,断头采血,并于冰盒上快速取下创伤处皮肤。皮肤组织液氮冷冻后置于-80℃冰箱备用,血液样品静置30~45min后,1000r/min离心15min,收集血清置于-80℃冰箱待测。皮肤组织检测前取出称重,按质量体积比(1∶8)加入按一定比例配置的RIPA、蛋白酶抑制剂和PMSF混合液中,人工剪碎组织后,采用多功能样品匀质器研磨,1000r/min离心15min,收集上清置于-80℃冰箱待测。灌流取材:造模后第5天艾灸干预后,用含4%多聚甲醛和0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)的固定液对每组3只大鼠经心脏灌流,在大鼠背部创伤周围取相同大小的皮肤组织,于4%多聚甲醛中后固定2~4h,然后存放于含25%蔗糖的0.1mol/LPB(pH7.4)中,放置于4℃冰箱里待组织自然下沉[13]。将取下的背部皮肤组织沿背部正中纵向切开修剪后,置于恒冷箱保存。

Bio-Plex悬浮芯片系统检测皮肤组织中VEGF与血清中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-4、、IL-10、IL-13、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α、VEGF的含量:血清样品用样品稀释液做3倍稀释,皮肤组织上清蛋白定量后稀释为1mg/mL,标准品根据说明书用标准品稀释液进行倍比稀释,漩涡混合1~3s,冰浴30min后使用。稀释好的标准品、血清样品、皮肤组织样品室温平衡20min以上,漩涡混匀。每孔加入50!L微珠,洗板2次后,轻弹样品和标准品管3~5次,每孔加入50!L,铝箔盖住,1100r/min室温摇床30s后,再以850~900r/min避光摇2h。稀释好检测抗体,洗板3次后,轻弹检测抗体管3~5次,每孔加入25!L,用铝箔盖住,先1100r/min室温摇床孵育30s,再以850~900r/min避光摇1h。同时稀释好Streptavidin-PE,洗板3次后轻弹Streptavidin-PE管3~5次,每孔加入50!L,用铝箔盖住,1100r/min室温摇床孵育30s,再以850~900r/min避光摇20min;洗板3次后用125!LBio-Plex分析缓冲液重悬微珠,以密封袋盖住,1100r/min室温摇床孵育30s,放入仪器中进行读板检测。使用Bio-Plex200系统,HighPMT设置进行读板,计算细胞因子含量。

免疫荧光染色法检测皮肤组织新生血管数量:皮肤组织纵向切片,厚度为20μm,用含3%驴血清、0.5%TritonX-100和0.1mol/LPB(pH7.4)的封闭液封闭组织切片1h,去除封闭液后,滴加CD31抗体(1∶1000)并置于湿性暗盒中4℃过夜。次日,经0.1mol/LPB洗片3次后,滴加Alexa488荧光素化二抗(1∶500),室温孵育1h。再用0.1mol/LPB洗片3次,然后用DAPI复染5min,洗净后,用50%的甘油封片,激光共聚焦显微镜观察结果并拍照。

1.6统计学处理

采用SPSS16.0统计软件包进行数据分析。各组数据经过正态检验和方差齐性检验后,符合正态分布的数据结果以均数±标准误表示。方差齐时,艾灸组与模型组比较采用独立样本t检验,方差不齐时,采用校正t检验,以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。

2结果

2.1艾灸对创伤模型大鼠血清炎性细胞因子含量的影响

如图1所示,模型组大鼠血清中IL-1α、IL-1β和IL-6的含量在创伤后呈现先升高后降低的趋势,在第3天达到顶峰。艾灸组大鼠血清中IL-1α、IL-1β、IL-6的含量在造模后前2d维持较高水平,并在第3天开始下降。与模型组比较,造模后第1天艾灸组大鼠血清中IL-1α和IL-6的含量显著升高(P<0.05),造模后第1、2天艾灸组大鼠血清中IL-1β的含量显著升高(P<0.05),造模后第3天艾灸组血清中IL-1α和IL-6的含量显著降低(P<0.05)。

如图2所示,模型组大鼠血清中IL-4、IL-10、IL-13的含量在创伤后呈现先升高后降低的趋势,IL-4在第2天达到顶峰,IL-10、IL-13在第3天达到顶峰。艾灸组大鼠血清中IL-4、IL-10、IL-13的含量在造模后前2d维持较高水平,第3天开始下降。与模型组比较,艾灸组大鼠造模后第1天血清中IL-4和第1、2天IL-10的含量升高(P<0.05,P<0.01),而造模后第3天血清中IL-4、IL-10的含量降低(P<0.05),IL-13的含量虽差异无统计学意义(P>0.05),但与IL-10的变化呈现相同的趋势。

2.2艾灸对创伤模型大鼠血清G-CSF、GM-CSF、MIP-1α的影响

如图3所示,模型组大鼠血清中G-CSF含量在造模后5d内呈现较平稳的趋势,GM-CSF在造模后第2天含量稍有升高,MIP-1α的含量逐渐升高,在第5天达到峰值。艾灸组大鼠血清中G-CSF、GM-CSF的含量在造模后前2d维持较高水平,第3天开始下降;MIP-1α的含量在前3d维持较高水平,第5天下降。与模型组比较,艾灸组大鼠造模后第2天血清中G-CSF的含量升高,第3天和第5天含量降低;艾灸组大鼠前3dGM-CSF的含量升高,在第5天降低;艾灸组大鼠前3dMIP-1α的含量均升高,且在造模后第2天明显升高(P<0.05),在第5天下降。

图1两组大鼠不同时间点血清IL-1α、IL-1β、IL-6含量的比较(,9只鼠/组)

注:正常组(6只鼠/组)参考值分别为IL-1α(503.12±33.17)pg/mL,IL-1β(166.47±10.58)pg/mL,IL-6(1133.23±113.21)pg/mL。与模型组比较,*P<0.05。

图2两组大鼠不同时间点血清IL-4、IL-10、IL-13含量的比较(9只鼠/组)

注:正常组(6只鼠/组)参考值分别为IL-4(70.51±4.79)pg/mL,IL-10(1289.16±78.19)pg/mL,IL-13(167.72±12.02)pg/mL。与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。

图3两组大鼠不同时间点血清G-CSF、GM-CSF、MIP-1α含量的比较(,9只鼠/组)

注:正常组(6只鼠/组)参考值分别为G-CSF(81.10±2.53)pg/mL;GM-CSF(196.32±6.73)pg/mL;MIP-1α(78.78±2.60)pg/mL。与模型组比较,*P<0.05。

2.3艾灸对创伤大鼠血清VEGF和创伤局部新生血管的影响观察

如图4所示,与模型组比较,艾灸组大鼠造模后第1、2天血清中VEGF的含量显著升高(P<0.01,P<0.05),第3天和第5天其表达仍维持在较高水平(P<0.05)。与模型组比较,艾灸组大鼠造模后第1、2、3天创伤组织中VEGF的含量差异无统计学意义(P>0.05),造模后第5天创伤组织中VEGF的含量显著升高(P<0.01)。

免疫荧光结果显示,与模型组比较,艾灸组创伤模型大鼠造模后第5天创伤组织中新生血管数量明显增加,与VEGF定量结果一致。见图5。

3讨论

本研究结果显示,造模后1~2d艾灸组大鼠血清中促炎细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6和抗炎细胞因子IL-4、IL-10的含量升高,并在第3天降低;艾灸促进了巨噬细胞炎性蛋白MIP-1α在大鼠创伤模型后第2天血清中的含量,并且升高G-CSF、GM-CSF的含量。艾灸显著促进了创伤模型大鼠创伤炎性早期(造模后1~2d)血清中VEGF的表达,且使其表达持续(造模后1~5d)维持在较高水平,并显著提高了创伤模型大鼠造模后第5天创伤组织中VEGF的表达以及CD31的阳性表达。

炎性期是创伤愈合过程中最重要的阶段,中性粒细胞首先(24h内)到达损伤部位,巨噬细胞紧随其后,巨噬细胞在损伤后大约48h内浸润到损伤部位,直至炎性期结束。炎性期结束后,进入创伤修复的增殖和重塑期,血管新生是这一阶段的重要环节。研究[11]显示,VEGF及受体对创伤组织处血管新生有重要作用。本研究结果显示,艾灸促进创伤模型大鼠血清中VEGF持续高表达,并促进创伤修复期创伤局部组织VEGF和CD31的高表达,提示艾灸促进创伤模型大鼠伤口愈合提前进入修复阶段。与巨噬细胞迁移关系密切的炎性因子G-CSF、GM-CSF的表达有升高的趋势,而艾灸促使MIP-1α在创伤模型制备后第2天(约造模后36~48h)明显升高。MIP-1α是一种强效创伤单核细胞趋化因子[15],创伤初期由血小板释放[16],炎性期主要由巨噬细胞释放[17],可以促进巨噬细胞向损伤部位迁移。炎性反应由炎性细胞向创伤组织募集而启动,炎性反应不足与炎性反应过度都会导致创伤愈合不良,诸多炎性细胞因子介导了这一过程。有研究[2]表明,组织损伤后的缺血缺氧环境可促进IL-1α前体升高,并从死亡细胞释放,而IL-1α在炎性早期的升高与中性粒细胞浸润关系密切,IL-1β则促进了巨噬细胞的迁移,炎性早期经典活化的M1型巨噬细胞进一步分泌IL-1、IL-6,IL-6在感染和组织损伤时,发挥促炎和促进宿主防御的免疫作用[18]。本研究观察到艾灸后创伤模型大鼠血清中IL-1α、IL-6在造模后第1天,即艾灸干预2次后显著升高,大鼠血清中IL-1β在造模第1、2天后均显著升高,而造模后第3天IL-1α、IL-1β、IL-6显著降低,提示艾灸促进了创伤早期的促炎反应,并提前结束了促炎细胞因子的作用。本研究通过观察艾灸后IL-4、IL-10、IL-13在创伤模型大鼠血清中的表达发现,IL-4、IL-10存在与促炎细胞因子相似的表达趋势,艾灸后1~2d创伤模型大鼠血清中IL-4、IL-10显著升高,并在第3天显著下降,IL-13的表达差异无统计学意义,但趋势一致。实验研究[19]表明,IL-4参与抗炎过程和巨噬细胞分化;IL-10可以增强IL-4促进M-CSF诱导的巨噬细胞向M2型转变的作用[20];IL-10可以通过影响炎性细胞向伤口处募集,抑制促炎细胞因子和趋化因子的表达[21],IL-10抑制炎性反应的作用在大鼠与小鼠创伤愈合中均得到证实[22,23]。因此提示,艾灸调控促炎细胞因子促进创伤炎性反应的同时,也调控了抗炎细胞因子在这一过程中的作用。艾灸可能通过激活一系列炎性细胞因子的促炎和抗炎反应,使促炎和抗炎达到新的平衡,有利于创伤修复。

图4两组大鼠不同时间点血清及皮肤组织VEGF含量的比较(±sx,9只鼠/组)

注:正常组(6只鼠/组)参考值分别为VEGF(血清)(11.46±0.86)pg/mL;VEGF(皮肤)(38.18±1.40)pg/mg。与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。

图5两组大鼠造模后第5天CD31标记的血管

注:A和A1为模型组造模后第5天创伤局部组织中CD31表达情况;B和B1为艾灸组造模后第5天创伤局部组织中CD31表达情况;图A1、B1为图A、B中方框标记区域放大图。绿色为CD31标记的血管内皮细胞,蓝色为DAPI标记的细胞核。

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